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羊水細(xì)胞培養(yǎng)_干細(xì)胞搜網(wǎng)_www.stemcell.so

更新時(shí)間:2014-05-13

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干細(xì)胞搜網(wǎng)實(shí)驗(yàn)室人員教您如何做好羊水細(xì)胞培養(yǎng)

 

羊水中含有胎兒脫落的上皮細(xì)胞,可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國(guó)內(nèi) 外大都采用腹腔羊膜穿刺術(shù),妊娠12-30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析,*孕周為16周左右。因此時(shí)羊水增長(zhǎng)快,羊水中細(xì) 胞較多,細(xì)胞培養(yǎng)易于生長(zhǎng),而且不易損傷胎兒。國(guó)內(nèi)多數(shù)選擇的穿刺時(shí)間在妊娠的第16-30周。國(guó)外現(xiàn)已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺,但需在B超下定位 及穿刺。羊水量按妊娠時(shí)間大致計(jì)算(1ml/w)。資料表明,穿刺病例的妊娠結(jié)局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無(wú)明顯差異。

 

  1、實(shí)驗(yàn)材料
  2,5%碘酒、75%酒精、無(wú)菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號(hào)無(wú)菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液(PRMI 1640、199、F10、F12)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。
  2、培養(yǎng)液配制
  F-12 85%
  小牛血清 15%
  雙抗 100u/ml
  小瓶貯藏 4-8℃
  3、操作過程


  A(蓋玻片培養(yǎng)法)


  (1)采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無(wú)菌離心管中;(2)收集:離心分離細(xì)胞,1000rpm10分鐘,去 上清,留0.5ml,輕打混勻;(3)接種:30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張,每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘;(4)培養(yǎng):取 出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml,靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時(shí)換液,5-10天后,可見大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng);(5)終止培養(yǎng):當(dāng) 有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí),加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時(shí);(6)低滲:倒掉培養(yǎng)液,加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液 5ml,37℃溫育30分鐘,鏡下可見脹大的羊水細(xì)胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液預(yù)固定;(7)固定:倒掉低滲液,加5ml固定液固定30分鐘以上,反復(fù)3次;(8)干燥:將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中, 置80℃烤箱處理2-3小時(shí);(9)膠片:將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上,正面朝外,小心細(xì)胞破壞;


  B(常規(guī)培養(yǎng)法)


  (1)—(2)相同于蓋玻片培養(yǎng)法;(3)接種:將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶 加5-10ml混合培養(yǎng)液。(4)培養(yǎng):酒精燈火先封口,靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞貼臂及生長(zhǎng)情況,5-10天后可見瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長(zhǎng);(5) 終止培養(yǎng):同A法;(6)細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,輕輕搖動(dòng),使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶, 然后用彎頭吸管吹打,待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘,棄上清,留細(xì)胞沉 慮。若一次消化不*,可反復(fù)消化;(7)低滲及預(yù)固定:加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml,37℃溫育30分鐘,加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰 乙酸固定液預(yù)固定,用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。(8)固定:用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分鐘。固定液加入時(shí)沿管壁緩慢加入;(9)制片及干 燥:用絨毛制片;
(10)分帶處理。

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