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WGA技術(shù)如何選擇?

更新時間:2021-07-13

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單細胞全基因組測序技術(shù)是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項技術(shù),其原理是對分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序,廣泛應(yīng)用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究。
  獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴增產(chǎn)物是準確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴增,在單細胞測序技術(shù)誕生的近二十年時間里,全基因組擴增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革,WGA主要有三種方式:DOP-PCR,MDA,MALBAC。下面小編就來為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程,以及怎樣根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴增方式。

 

 

DOP-PCR

 

 

(Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)

  技術(shù)原理:簡并寡核苷酸引物PCR,引物的3' 含6bp的隨機序列,可以隨機的和基因組DNA結(jié)合,從而實現(xiàn)對全基因組的擴增[1]。

  應(yīng)用范圍:因為PCR的指數(shù)擴增特性,放大了基因組上不同序列之間的差異,因而導(dǎo)致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此,在1M bin size的水平上,DOP-PCR適合對染色體的CNV進行定量。
 商品化試劑盒:Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit

  

 

 

 

 

MDA

 

 

(Multiple Displacement Amplification)

  技術(shù)原理:2001年由Laskin團隊發(fā)明,使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進行反應(yīng),該聚合酶具有很強的鏈置換特性,能夠在等溫的條件下,擴增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性,φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性[2]。
  應(yīng)用范圍:MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度,φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性,使得MDA法在對SNV的分析,以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是,和DOP-PCR相同,MDA法依然是指數(shù)擴增,因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性,然而,和DOP-PCR不同的是,這種偏好性并不能重復(fù),因此MDA法不適合進行CNV的分析。

  商品化試劑盒:Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 

   

 

 

 

 

 

MALBAC

 

 

 (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

  技術(shù)原理:2012年由謝曉亮團隊發(fā)明,擬線性的擴增過程降低了指數(shù)擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列,3’是8bp的隨機序列,可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合,經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴增后,再對這些環(huán)狀的擴增子進行指數(shù)擴增[3]。
  應(yīng)用范圍:MALBAC法的優(yōu)勢在于,雖然它依然存在一定的序列偏好性,但和MDA不同,MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復(fù)的,因此可以通過對參考細胞標準化后,進行CNV的分析;另外,由于其擴增的均一性,MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點在于,它使用的聚合酶保真性不如φ29,因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性;另外,由于它可重復(fù)性的序列偏好性,基因組上低擴增的區(qū)域有時會在擴增過程中丟失。

  商品化試劑盒:Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit.

 

 

 

由上述的分析可見,MDA和MALBAC各有優(yōu)劣,實際上在不同的文獻中,研究者也會根據(jù)研究目的的不同,采取不同的方式對基因組進行擴增,以滿足研究的需要[5-7]

 

 

 

picoplex特殊隨機引物起始的熱循環(huán)擴增

 

 

 
 

picoplex技術(shù)相比于以往的PCR、MDA、MALBAC為基礎(chǔ)的單細胞全基因組擴增技術(shù),操作簡便,擴增重復(fù)性良好。特別設(shè)計的隨機引物(參加US patent 8,206,913)能減少引物二聚體的形成,從而提高引物和模板的配對效率。

 

 

 

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